Arbeitsschritte:

• Vervielfältigung der zu untersuchenden DNA-Abschnitte mittels PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion)
• Zugabe von vier fluoreszenzmarkierten Nukleotiden (je eine Farbe für die vier Basen A,C,T,G)
• Auslesen der Basenfolge auf modernen Sequenziergeräten mittels Laserdetektion
• Bioinformatischer Abgleich der erhaltenen Sequenzinformation gegen das Referenzgenom
• Bioinformatische Klassifikation beobachteter Sequenzveränderungen bzgl. ihrer funktionellen und möglichen klinischen Auswirkungen unter Berücksichtigung der ACMG-Kriterien

Grenzen: Dosisveränderungen des gesamten untersuchten Gens oder einzelner Abschnitte (Exondeletionen/-duplikationen) können mit der Sanger Sequenzierung technisch nicht erfasst werden, ebenso wenig wie strukturelle Umbauten z.B. im Rahmen von Inversionen, Translokationen und Mikrodeletionen/-duplikationen, die dieses untersuchte Gen betreffen, sowie Splice-Mutationen und Varianten in regulatorischen Regionen außerhalb der analysierten Bereiche.

Eine begrenzte Aussagekraft hat diese Methodik auch bei der Erfassung von Mosaikbefunden.

Arbeitsschritte:

• Spezifische Sondenpaare werden in den einzelnen Genabschnitten an die denaturierte Patienten-DNA gebunden (hybridisiert) und anschließende mit Hilfe einer thermostabilen Ligase verbunden.
• PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) zur Generierung und Vervielfältigung von PCR-Produkten für jedes einzelne Sondenpaar.
• Auftrennung dieser PCR-Produkte nach ihrer Größe mittels Kapillarelektrophorese
• Quantitative computergestützte Auswertung der Ergebnisse im direkten Vergleich mit Referenzproben

Grenzen: Vorhandene Dosisdifferenzen können nur für den direkten Sequenzbereich der verwendeten Sondenpaare detektiert werden. Seltenere, kleinere Deletionen oder Duplikationen zwischen den eingesetzten Sonden können daher nicht erfasst werden. Auch Sequenzveränderungen in den untersuchten Genen oder Abweichungen der Chromosomenstruktur (z.B. Translokationen) werden mit dieser Methodik nicht erkannt. Ebenso können mit MLPA auch keine Dosis- oder Sequenzveränderungen in anderen Genen oder Chromosomenveränderungen erkannt werden. Falsch positive Befunde können z.B. durch (auch gutartige) Sequenzveränderungen im direkten Bereich der Sondenbindungsregionen entstehen.

Definition des Analyseumfangs anhand der klinischen Fragestellung als

- Genpanel (mehrere Gene,  in welchen in der Literatur sowie Mutationsdatenbanken schon mehrfach krankheitsursächliche Sequenzveränderungen beschrieben wurden),
- klinisches Exom (Sequenzanalyse aller humanen kernkodierten Gene, welche bisher mit einem klinischen Phänotyp assoziiert wurden). Die bioinformatische Durchsicht erfolgt hierbei unter Verwendung standardisierter klinischer Symptome (HPO-Terms) oder
- klinisches TRIO-Exom unter Einbeziehung der bioinformatischen Exomdaten beider leiblicher Eltern. Dies erleichtert eine Zuordnung beobachteter Sequenzveränderungen als krankheitsursächlich, z.B. durch Ausschluss bei beiden Eltern für Neumutationen (de novo) oder kann eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung für einen Patienten sichern mit Nachweis einer heterozygoten Anlageträgerschaft bei beiden Eltern. Hierdurchkann die Diagnoserate erhöht werden.

Arbeitsschritte:
Herstellung einer Probenspezifischen DNA-Bibliothek:

• enzymatische Fragmentierung der genomischen DNA
• Ligation universeller Sequenzieradapter und patientenspezifischer Barcodes an diese Fragmente
• Aufreinigung

Amplifikation der Ligationsprodukte und Quantifizierung

Paralleles Auslesen der Sequenzdaten im Hochdurchsatz mittels Laserdetektion

Grenzen: Abweichungen der genomischen Chromosomenstruktur (z.B. Translokationen), Repeatexpansionen, heterozygote Mikrodeletionen und -duplikationen von mehr als 15bp, Varianten in homopolymeren Bereichen oder bei hoher Homologie zu Pseudogenen sowie Splice-Mutationen und Varianten in regulatorischen Regionen außerhalb der analysierten Bereiche können technisch bedingt nicht erfasst werden.

Bei etwa 1% aller infertilen Männer liegt als genetische Ursache eine Mikrodeletion in der AZF-Region des Y-Chromosoms vor. Diese kann durch eine Multiplex-Amplifikation von sechs Markern aus den Regionen AZFa, AZFb und AZFc nachgewiesen werden. Zusätzlich wird mit dieser Methode das SRY (Sex determining region of Y-Chromosome)-Gen als Kontrolle erfasst. Dieses Gen dient der Geschlechtsbestimmung beim Menschen und liegt im Normalfall auf dem kurzen Arm des Y-Chromosoms.

Die Methode des Elucigene CF-DE Kit basiert auf einer allelspezifischen PCR (ARMS = Amplification Refractory MutationSystem) mittels derer Punktmutationen sowie Insertionen oder Deletionen nachgewiesen werden können.